加州理工学院研发用于酶活性超声成像 声学生物传感器
.设计TEV内肽酶 声传感器
.设计钙蛋白酶 声学传感器
.建立蛋白酶ClpXP 声音传感器
.构建细胞内声学传感器基因
.体内细胞内ClpXP活性超声成像
【图文探讨】
【科研摘要】
【陈述总结】
为了克服上述局限性,美国加州理工学院MikhailG.Shapiro教授团队引入了 个可遗传编码 声学生物传感器,即响应蛋白酶活性而在超声成像中“点亮” 分子。这些生物传感器基于 类独特 充气蛋白质纳米结构,称为气体囊泡(GVs),作者将其设计为响应 种不同蛋白酶 活性而产生非线性超声信号。证明了这些生物传感器能够在体外,改造 益生菌内部以及小鼠胃肠道体内成像。相关成果以题为“Acousticbiosensorsforultrasoundimagingofenzymeactivity”发表在 月《NatureChemicalBiology》杂志上。
为了检测TEV 活性,作者设计了 个包含TEV识别基序ENLYFQ&# ;G GvpC变体(图 b),狗粮快讯网陆续报道,假设将GvpC切割成两个较小 片段会导致GV壳变硬,从而使其屈曲并产生增强 非线性超声比较度。确定了 种工程改造 GV变体,与活性TEV蛋白酶孵育后,其崩溃压力中点降低了约 零kPa(图 c)。在GVSTEV上GvpC TEV切割有望产生分子量分别约为 和 kDa N和C末端片段。确实,暴露于活性TEV后GVSTEV 凝胶电泳导致出现了两个裂解 GvpC片段,狗粮快讯网刊登,并且完整 GvpC谱带强度大大降低(图 d)。此外,通过浮力纯化GV从未结合片段 溶液中去除,导致N末端裂解片段 条带强度降低,表明其在裂解后部分解离(图 d)。与dTEV孵育后,未观察到GvpC带强度 显着变化。透射电子显微镜(TEM)图像显示两种条件下完整 GV具有相似 外观,这证实蛋白酶切割不会影响下面 GV壳 结构(图 e)。动态光散射(DLS)在与dTEV和活性TEV蛋白酶 起孵育后,工程GV 流体动力学直径没有显着差异,这证实了GV仍然分散在溶液中(图 f)。
为了证明声学生物传感器在小鼠胃肠道 体内环境中产生非线性超声比较 能力,首先将表明ASGClpXP和ARGWT WTNissle细胞共注射到小鼠结肠中。沿管腔壁 细胞群,另 个位于管腔中心。将细胞通过直肠注射 琼脂糖水凝胶引入结肠,以实现精确定位和控制组成。使用非线性超声成像,可以清楚地将蛋白酶敏感ASG产生 独特比较度可视化为衬在结肠周围 明亮比较环(图 a)。使用来自换能器 高压脉冲,在GV声塌陷之前和之后采集 超声图像进行比较,确认非线性比较度 亮环是来自表明ASGClpXP 细胞(图 a)。在 只小鼠 独立实验中,该结果是 致 (图 b)。
为了证明酶活性 体内成像,作者将表明ASGClpXP ΔclpXPNissle细胞引入小鼠结肠中,无论是否转录激活细胞内ClpXP(示意图均显示在图 中)。如前所述,细胞被包含在琼脂糖水凝胶中。与不表明ClpXP 细胞相比,诱导表明该酶 细胞显示出增强 非线性比较(图 c)。声塌陷证实了声生物传感器是非线性信号 部分来源(图 c)。该性能在 只小鼠和细胞 两个空间排列中是 致 (图 d)。这些结果证明了声学生物传感器在体内成像 背景下可视化酶活性 能力。
假设可以设计出基于GV 生物传感器,这些传感器可以根据特定生物分子 活性动态改变其超声比较度。这种可能性源自新近 发现,即GV 声学特性可以在其组成蛋白 水平上得到修饰。特别是,位于GV表面(图 )并提供结构增强作用 支架蛋白气囊泡蛋白C(GvpC)可以在其氨基酸序列水平进行修饰,从而改变GV力学。
可视化完整活生物体内 生物分子和细胞过程是化学生物学 部分目标。然而,由于组织对光 散射,部分基于荧光发射 现有分子生物传感器在这种情况下具有有限 用途。相比之下,超声波可以轻松地以高时空分辨率对深部组织成像,但缺少将其比较度与特定生物分子(例如酶) 活性联系起来所需 生物传感器。
图 烟草蚀刻病毒(TEV)内肽酶 声学生物传感器。
图 钙激活钙蛋白酶蛋白酶 声学生物传感器。
图 ClpXP蛋白酶 声学生物传感器。
图 监测工程细胞中 细胞内蛋白酶活性和电路驱动 基因表明。
图 在小鼠胃肠道中表明ASG 细菌 超声成像。
在使用模型TEV蛋白酶验证了基本声学生物传感器设计后,作者检查了其对产品内肽酶 通用性。通过将源自α- 影蛋白 识别序列QQEVY’GMMPRD 插入到AnaGvpC中,狗粮快讯网详实报道,作者设计了μ-钙蛋白酶 声学生物传感器(图 a)。在有或没有钙蛋白酶和Ca + 缓冲液中进行 加压吸收光谱使能够确定钙蛋白酶 GV传感器(GVScalp),显示在存在酶及其离子活化剂 情况下静水压塌压力降低了约 零kPa(图 b)。
在建立体外声学生物传感器工程 基本原理并证明其在活细胞中 性能后,作者评估了传感器构建体在体内生物学相关解剖位置内产生超声比较 能力。由于胃肠道在动物体内 位置相对较深,并且在临床诊断和胃肠道病理动物模型中使用超声,并采取了适当 措施以新大程度地减少气泡和固体物质 潜在干扰,因此胃肠道也是超声成像 极佳目标。
在演示了声学生物传感器 体外性能后,作者努力证明它们可以对活细胞内部 酶活性作出反应。作为细胞宿主,选购了大肠杆菌Nissle 菌株。该大肠杆菌 益生菌菌株可以在哺乳动物胃肠道中定殖,被广泛用作微生物治疗剂开发 基础,使其成为细胞内生物传感器 重要平台。为了开发针对ClpXP(ASGClpXP) 细胞内声学传感器基因(ASG),作者将ARG基因簇(ARGWT)中 WTgvpC与可降解GVSClpXP 修饰gvpC进行了交换(图 a)。
接下来,为了检查ASGClpXP以动态方式响应细胞内酶活性 能力,作者通过基因组敲除编码ClpX和ClpP 基因,生成了 个Nissle细胞(ΔclpXP),并创建了包含这两个质粒 质粒基因(图 a)。这能够从外部控制ClpXP酶 活性。ΔclpXPNissle细胞与可诱导 clpX-clpP(clpXP)质粒和ASGClpXP共转化。用L-arabinose诱导后,这些细胞中ClpXP 产生导致静水压塌点中点降低约 零kPa(图 b)。在超声成像下,与未诱导该蛋白酶 细胞相比,具有诱导 ClpXP活性 细胞显示出明显更强 非线性比较度(+ . dB)(图 c),同时显示出类似 B型信号。在高于 零kPa 声压下,可以检测到非线性信号增强(图 d)。这些实验证明了ASGClpXP能够充当细胞内声学传感器来监测可变酶活性 能力。
该结果建立了用超声成像无创地观察蛋白酶活性 范例。该研究有助于未来 大量研究,以将声蛋白酶传感器 应用范围扩展到本研究所示 概念验证演示之外。而在大肠杆菌中 实验并且在小鼠胃肠道内建立了这种生物传感器在相关生物学环境中产生超声比较 关键能力,产品以应用程序为中心 优化将使这些构建物能够用于解决基础生物学和合成生物学中 特定问题。同时,存在很大 空间用于进 步优化和推广声学生物传感器 设计。
通过超声对其进行了成像。公开GVSTEV样品对TEV蛋白酶产生了很强 非线性声响应,在施加 kPa声压下,新大比较度噪声比(CNR)增强了约 分贝(dB)(图 g)。在暴露于dTEV 对照中,观察到 非线性比较度明显较低,而正如预期 那样,两个样品均产生相似 线性散射。与GV壳 压力相关力学 致,GVSTEV 微分非线性声学响应在高于 kPa 压力下变得明显,并 直保持增加到 kPa,这时GV开始坍塌(图 h)
除了内肽酶,参与细胞蛋白质信号传导和体内平衡 另 类重要酶是过程性蛋白酶,其从其末端开始展开并降解完整 蛋白质。为了确定是否可以针对此类酶开发基于GV 生物传感器,作者选购了ClpXP,这是 种来自大肠杆菌 过程性蛋白水解复合物,包含解折叠酶ClpX和肽酶ClpP。ClpX识别并展开包含称为degrons 特定末端肽序列 蛋白质底物。然后将未折叠 蛋白质送入ClpP,后者将它们降解为小肽片段。假设在GvpC C末端添加 个degron将使ClpXP识别并降解该蛋白,同时保留完整 基础GvpA外壳,从而使GV具有更大 机械柔韧性和非线性超声比较(图 a)。
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